Biologie Appliquée. Dosages Immunologiques TD9 Mai Stéphanie Sigaut INSERM U1141

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1 Biologie Appliquée Dosages Immunologiques TD9 Mai 2015 Stéphanie Sigaut INSERM U1141 1

2 ELISA 2

3 3

4 4

5 [Ac] 5

6 6

7 7

8 8

9 9

10 Correction : Faire la moyenne D0-1 et D0-2 pour toute les valeurs (A-H) Soustraire au valeur de gamme et à l échantillon soit le Blanc (A) soit le témoin négatif (C-) s il est réalisé. Ici on enlève C- 10

11 On trace la gamme étalon en reportant les valeurs de DO (en bleu) Gamme étalon Moyenne DO1 et DO2 Moyenne DO DO C - C - 0, ,431 1, ,3413 1, ,0425 0, ,7905 0, ,609 0,34? 1,0715 0,8025 DO Titre(U/ml) Le dernier point sort de la gamme : on le retire, on trace la droite et on reporte la valeur de DO de l'echantillon sur la droite : on obtient une valeur de titre : l'échantillon est dosé Réponse : 26,087U/ml Gamme étalon y=0, ,2982 R 2 = 0,9664 DO Titre (U/ml) 11

12 Le patient A n est pas positif pour la présence d anticorps anti-vih Le patient C est positif, sa valeur de DO est > 0,5 Le patient B présente un résultats < 0,5 mais >0,3. Les patient B et C seront testé une deuxième fois et les échantillons seront également analysés en WB 12

13 Western-Blot 3 grande étapes : A partir d extraits protéiques, on réalise : 1. Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour séparer des protéines, préalablement dénaturées, selon leur masse. 2. Un transfert des protéines sur une membrane 3. La révélation d une ou plusieurs protéines d intêret

14 Electrophorèse : Les protéines de l'échantillon sont séparées selon leur taille par électrophorèse sur gel Les gels de polyacrylamide sont les plus fréquents : Ils sont constitués d'acrylamide qui est l'unité de base et de bisacrylamide qui est l'agent pontant. En fonction des différents taux de ces deux substances on obtient différents maillages qui sera adapter en fonction des protéines que l on souhaite séparer. Les protéines ne traversant le gel que dans une dimension (du haut vers le bas), les échantillons sont chargés l'un à côté de l'autre dans des puits formés dans le gel. Les protéines sont séparées en fonction de leur dans chaque «couloir» formé sous les puits. Plus elles sont petites plus elles vont loin. Un couloir est réservé à un «marqueur» ou «échelle standard», une mixture de protéines possédant des poids moléculaires définis disponibles dans le commerce. 14

15 Transfert : Afin de rendre les protéines accessibles à la détection par anticorps, elles sont transférées depuis le gel sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF Les protéines chargées migrent depuis le gel vers la membrane en conservant l'organisation relative qu'elles avaient dans le gel. Les protéines ainsi exposé peuvent être accessibles aux anticorps permettant de marquer une protéine d interêt. 15

16 Détection : 1. Blocage La membrane ayant été choisie pour ses propriétés a fixer les protéines des précautions doivent être prises pour minimiser les interactions entre membrane et anticorps : on incube donc les membrane dans une solution diluée de protéines : le plus souvent de l'albumine de sérum bovin. 2. Immnodetection Une solution diluée d'anticorps dirigé contre une protéine cible est incubée avec la membrane Après rinçage de la membrane afin d'enlever les anticorps primaires non liés, celle-ci est exposée à un anticorps secondaire, dirigé contre un motif de l anticorps primaire spécifique de l espèce chez laquelle il a été généré. Cette anticorps secondaires peut être couplé à un fluorochrome : après stimulation de la membrane avec un rayon monochromatique, l'émission de lumière à une longueur d onde donnée qui en résulte est alors détectée (par exemple une caméra CCD équipée des filtres appropriés) et une image numérique est restituée = Détection par fluorescence

17 Cette anticorps secondaires peut être couplé à une enzyme : - La HRP (Horseradish Peroxydase) qui en présence d un substrat approprié Le luminol, émet une lumière capable d impressionner un film photographique, ou plus récemment, par des caméras CCD qui restituent une image numérique = Détection par chimioluminescence - La phosphatase alcaline convertit un colorant soluble en une forme insoluble, de couleur différente, qui précipite à côté de l'enzyme, teintant donc la membrane de nitrocellulose = Détection colorimétrique 17

18 18 Taille: p55 : 55 Kda, IN : environ Kda, CA: environ 25 Kda et MA: environ 16-17KDa P2 est négatif et P3 est positif pour les protéines virales p55, IN, CA et MA.