FLUORESCENCE ET TESTS FONCTIONNELS Association Française aise de Cytométrie. 18 janvier 2007

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1 FLUORESCENCE ET TESTS FONCTIONNELS Association Française aise de Cytométrie trie Journée e Thématique 18 janvier 2007 Cécile COTTET Laboratoire de Bioénerg nergétique Fondamentale et Appliquée e - Inserm U884- Grenoble

2 INTRODUCTION Plusieurs approches Cytométrie en Flux Cytométrie par analyse d images (2D, 3D, 4D) Points communs : - fluorescence - applications en recherche et en clinique

3 DETECTION DE LA FLUORESCENCE 4 éléments essentiels : - sources d excitation - fluorochromes - filtres d excitation et d émission - photodétecteurs Instruments - Spectrofluorimètres (µl à ml) - Systèmes macroscopiques (microarrays, gels électrophorèse ) - Microscopes à épifluorescence/confocaux - Cytomètres à flux

4 PROPRIÉTÉS S DU SIGNAL DE FLUORESCENCE L intensité de fluorescence est quantitativement dépendante de : l absorbance ou coefficient d extinction molaire ε: plus ε est grand, plus la fluorescence sera élevée à intensité lumineuse incidente égale le rendement quantique φ : φ = nombre total de photons émis dans tout le spectre d'émission de fluorescence / nombre de photons reçus et absorbés dans la zone spectrale d'excitation durée de vie du singulet excité le plus bas τ f = constante de temps de déclin de fluorescence

5 CRITÈRES RES DE CHOIX D UN D FLUOROCHROME Le marquage des cellules par des fluorochromes permet d'accéder à des informations arbitrairement classées en deux catégories : - les paramètres fonctionnels - les paramètres structuraux Le choix du (des) fluorochrome (s) sera fonction de : - sa spécificité (ADN, protéines, organites ) - son accessibilité (échantillons vivants ou non, perméabilisation ) - sa toxicité - sa stabilité - des lasers et filtres disponibles - des chevauchements de spectres (multimarquages)

6 FLUORESCENCE ET TESTS FONCTIONNELS Explorer une activité cellulaire ou une fonction biologique donnée In vitro : marquage fluorescent de composants ou structures de cellule en culture In vivo : photo-activation et expression de protéines/g ines/gènes imagerie du petit animal

7 VIABILITÉ VS APOPTOSE/NÉCROSE Mayol JF & Ronot X., (2006). Dans: La cytométrie en Flux. Ronot X., Grunwald D., Mayol JF. Boutonnat J. (eds) Lavoisier, Paris, 2006, pp

8 VIABILITÉ VS APOPTOSE/NÉCROSE Mayol JF & Ronot X., (2006). Dans: La cytométrie en Flux. Ronot X., Grunwald D., Mayol JF. Boutonnat J. (eds) Lavoisier, Paris, 2006, pp

9 VIABILITÉ VS APOPTOSE/NÉCROSE

10 VIABILITÉ VS APOPTOSE/NÉCROSE Lecoeur H., (2006). Dans: La cytométrie en Flux. Ronot X., Grunwald D., Mayol JF. Boutonnat J. (eds) Lavoisier, Paris, 2006, pp

11 VIABILITÉ VS APOPTOSE/NÉCROSE Effet du PACAP sur la toxicité de la β-amyloïde sur les CGC du cervelet de rat (calcéine/ip) Control PACAP Aß PACAP Aß Vaudry D., Cottet-Rousselle C. et al.(2004).regul Pept. Dec 15;123(1-3):43-9.4

12 ACTIVITÉ MITOCHONDRIALE Potentiel membranaire Le transfert des électrons le long des complexes de la chaîne respiratoire permet le pompage des protons de la matrice vers l espace intermembranaire, induisant un potentiel de membrane ΔΨ. Toute fuite inverse de protons (par l action de découplants par ex) provoque une dépolarisation.

13 ACTIVITÉ MITOCHONDRIALE monomère émission 520 nm J-aggrégats émission 585 nm Brown S. Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif

14 ACTIVITÉ MITOCHONDRIALE Mesure du potentiel membranaire de cellules U937 avec JC-1 Témoin +FCCP 25mM JC-1 agrégats JC-1 monomères JC-1 monomères

15 ACTIVITÉ MITOCHONDRIALE Cellules 3T3 Témoin +H 2 O 2

16 ACTIVITÉ MITOCHONDRIALE TMRM : Tétraméthylrhodamine Méthyl Ester Sensible au potentiel membranaire : (extinction de la fluorescence lorsqu il y a chute du ΔΨ)

17 ACTIVITÉ MITOCHONDRIALE HMEC : Dépolarisation par DNP Témoin + DNP Laurent ARGAUD : LBFA, U884 Grenoble

18 RELATION : ORGANISATION / FONCTION Organisation tissu-spécifique des mitochondries dans différents types de muscles Cardiomyocyte Cardiomyocyte + trypsine Muscle Squelettique L T L : 1,97 ± 0,43 µm T : 1,43 ± 0,43 µm L : 2,83 ± 0,65 µm T : 0,75 ± 0,22 µm Béraud N. et al. (2005). Am J Physiol Cell Physiol, 288: C757-C767

19 AU NIVEAU DE LA MEMBRANE Marqueur membranaire vital : PKH (Paul Karl Horan) Zyn-Linker - ancrage au niveau de la bicouche lipidique Fluorescent head group - répartition équivalente de la fluorescence X entre Y chaque cellule fille N+ N Lipophilic tails chromophore Lipid Bilayer Chaîne carbonée lipophile Double couche lipidique Cytoplasm cytoplasme

20 PROLIFERATION CELLULAIRE Suivi de la prolifération de cellules tumorales humaines de vessie traitées par un dérivé de flavonoïde nombre de cellules Témoin nombre de cellules Témoin fluorescence des PKH67 fluorescence des PKH67 nombre de cellules Témoin nombre de cellules Témoin fluorescence des PKH67 fluorescence des PKH67 Gerby B et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2006), doi: /j.bmcl

21 RECYCLAGE MEMBRANAIRE Internalisation du PKH67 dans les cellules L929 Rousselle C. et al, In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. (2001) Nov-Dec;37(10):

22 MIGRATION Dilinoleyl DiI : marqueur membranaire particulièrement adapté au suivi de la migration des neurones in situ

23 MIGRATION Observation in vitro de l émission d un prolongement de neurone Vaudry D. et Cottet-Rousselle C. Plate-forme d imagerie INSERM U413, IFR23. Mt St Aignan

24 MIGRATION Migration cellulaire in situ au sein du cortex de cervelet de rat Injection de DiI à la surface de EGL : Cellules granulaires externes accrochées à la surface une cellule commence à migrer verticalement vers IGL Émission d un prolongement Les cellules granulaires externes restent accrochées à la surface de EGL et émettent leurs prolongements à travers IGL Liesi et al. J Neurosci Res May 1;72(3):

25 ACTIVITÉ CALCIQUE Origines du Calcium dans la cellule : - extracellulaire via des canaux calciques - réticulum endoplasmique - autres compartiments intracellulaires (mitochondries, membrane nucléaire ) Rôle du calcium : - transduction intracellulaire d un stimulus extracellulaire avec une dynamique spatio-temporelle complexe Signal calcique li Signal calcique lié à : - expression de gènes précoces - différenciation et croissance cellulaires - contraction musculaire - endocytose et exocytose - chimiotactisme - régulation de protéines (kinases, phosphatases ) - apoptose (entrée massive dans mitochondries)

26 ACTIVITÉ CALCIQUE Fluo-4 Indicateur de Calcium : fluorescent à 526 nm en présence de Calcium

27 ACTIVITÉ CALCIQUE [Ca 2+ ] free = Kd [ F-Fmin]/[ Fmax-F] F min : intensité Fluo en absence de Ca 2+ F max : intensité de Fluo en Ca 2+ saturé

28 ACTIVITÉ CALCIQUE Propagation d une d onde calcique au sein de cellules astrocytaires marquées par Fluo4 et stimulées par le Cyclo-OP Leprince J. et al. Eur. J. Biochem. (2001) 268:

29 ACTIVITÉ CALCIQUE Mesure du calcium dans le réticulum sarcoplasmique dans une fibre musculaire contraction relaxation Fluo-5N 10µm Contraction = sortie du calcium dans cytosol Récupération = rentrée du calcium dans RS Kabbara AA & Allen DG.(2001) J.physiol : 87-97

30 LES PROTÉINES FLUORESCENTES Green Fluorescent Protein GFP Issue de la méduse Aequorea victoria, protéine intrinsèquement fluorescente isolée pour la 1ère fois en 1962 Le gène de la GFP peut être fusionné in vitro au gène d une protéine que l on souhaite étudier Le gène recombinant est ensuite réintroduit dans des cellules qui vont alors synthétiser la protéine chimérique fluorescente Permet d étudier les protéines dans leur environnement naturel : la cellule vivante!

31 QUELQUES MUTANTS de la GFP

32 GFP et biologie végétalev Localisation de la protéine TMM-GFP au niveau de l épiderme d Arabidospis Rôle de Too Many Mouths dans la différenciation de l épiderme, la formation et l organisation des stomates

33 GFP et petit animal Les facteurs de croissance confèrent l immortalité des cellules souches spermatogoniales Restauration de la fertilité de mâles stériles après transplantation de SSC (spermatogonial stem cells) Progénitures de souris transgéniques C57GFP x ROSA: 50% expriment GFP car les cellules transplantées sont haploïdes pour le transgène GFP Kubota H. et al.(2004)proc Natl Acad Sci U S A. Nov 23;101(47):

34 DAF-2DA : indicateur de monoxyde d azoted Principe de détection du NO par DAF-2DA

35 Monoxyde d azote d et Embryologie Rôle du NO au cours de la cardiogénèse d embryon de poulet Stade 26 HH tronc artériel Stade 29 HH Sac aortique Stade 36 HH Cloisonnement complet de l aorte MF-20 : anticorps anti-laminine DAF-2DA : monoxyde d azote Grimes AC. et al.(2006) Developmental Biology 290 :

36 IMAGERIE PETIT ANIMAL Mise au point d un vecteur moléculaire RAFT-Cy5 multifonctionnel pour l imagerie de tumeurs Ciblage spécifique de RAFT-Cy5 au niveau des métastases après injection intraveineuse Garanger E. et al (2005). Molecular therapy. Vol12 n 6:

37 QUANTUM DOTS plus brillants et plus stables que les sondes organiques traditionnelles

38 QUANTUM DOTS Atom Sondes fluorescentes Protéines fluorescentes Or colloïdal Bactérie Cellule animale

39 Les nanoparticules pour le diagnostic et la thérapie QUANTUM DOTS Anticancéreux encapsulés dans des nanoparticules, libérés au niveau des tissus ou cellules cancéreuses cibles Rotomskis R. et al.(2006) Medicina (Kaunas);42(7):

40 TESTS FONCTIONNELS ET F-TECHNIQUES FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer ou Trugnan et al. M/S 2004 : de nouvelles techniques pour voir la vie en couleur

41 TESTS FONCTIONNELS ET F-TECHNIQUES FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching ou Trugnan et al. M/S 2004 : de nouvelles techniques pour voir la vie en couleur

42 Des tests fonctionnels à «l art biologique» Alba, lapin transgénique fluorescent Eduardo Kac Telepresence & Bio Art Networking Humans, Rabbits and Robots Eduardo Kac University of Michigan Press